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核酸提取中蛋白酶k的作用下载_蛋白酶k裂解细胞(2024年11月测评)

内容来源：晓梦网所属栏目：新闻更新日期：2024-11-29

核酸提取中蛋白酶k的作用

RNA提取常见问题及解决方法详解 𐟌 RNA提取过程中，可能会遇到多种异常情况，如蛋白污染、DNA污染和RNA降解等。以下是一些常见问题的详细分析及其解决方法： 𐟔 问题1：RNA上样孔有荧光（蛋白污染）解决方法：使用蛋白酶K处理。重新用氯仿和异丙醇等抽提一遍。采用磁珠纯化：用2.2X的RNA磁珠纯化回收，并用80%乙醇漂洗。 𐟧젧で纯化详细操作步骤：准备工作：将RNA磁珠从冰箱取出，室温平衡至少30分钟。配制80%乙醇。涡旋振荡或充分颠倒磁珠，确保充分混匀。将RNA样本用dd水补充到50体系，吸取110（2.2X，磁珠:RNA=2.2:1）至RNA溶液中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5分钟。短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5分钟），小心移除上清。保持PCR管始终置于磁力架中，加入200新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒后，小心移除上清。重复步骤5，总计漂洗两次。保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5分钟）。将PCR管从磁力架中取出，加入适量ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5分钟，取上清，即为纯化后的RNA溶液。 𐟐‰ 问题2：RNA中有DNA污染原因：部分样本富含蛋白、多糖等，裂解过程中这些物质和核酸一起被释放，核酸易被这些粘稠的物质包裹，导致DNA污染。从某些组织（例如，脾、肾、胸腺）和或转染后的细胞中提取的RNA同样会倾向于存在更高水平的DNA污染。解决方法：选用DNA酶对样品进行DNA消化处理。之后再用磁珠或吸附柱将引入的DNA酶进行纯化去除。如果后续是做qPCR实验，逆转录的产品选择带有gDNA去除的逆转录试剂盒，则不需要额外处理。 𐟒‰ 详细操作方法： DNase发挥作用依赖部分离子浓度。DNase在缓冲液中含有Mg2+与Ca2+且不含其他盐的情况下具有最高活性。当标准反应缓冲液成分的盐（NaCl或KCl）浓度从0增加到30mM时，DNase1的活性会降低2倍多。DNase（低于10pg/ml）可以用来降低或者消除RNA样本中DNA的污染，但过高的浓度会影响后续的RT-PCR。一次DNase反应所能处理的RNA量取决于DNA污染的程度。用DNase去除DNA后，后续可用RNA提取柱式法自带的洗涤液洗涤样本，或者采用前述去蛋白的磁珠纯化的方式用2.2X的RNA磁珠纯化回收，用80%乙醇漂洗，即可得到较高纯度的RNA。 𐟓‰ 问题3：RNA降解原因：RNA提取保存过程中，很容易出现RNA片段的降解，尤其是针对一些RNA酶活性很强的组织，如胰腺组织、淋巴细胞、肿瘤组织等，本身代谢就比较活跃，如果取样不够及时，RNA容易出现不同程度的降解。解决方法：避免高温和辐射，避免操作过于剧烈。防止产生氧化反应和不适宜的pH值。用蛋白酶K或者RNaseA消化RNase，注意防止微生物污染等。通过以上方法，可以有效解决RNA提取过程中的常见问题，获得高质量的RNA样本。

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